La técnica conocida como la tinción de Gram fue creada por el médico e investigador Hans Christian Gram en el año 1884, usándola para poder identificar y clasificar los distintos tipos de bacterias en Gram positivas y Gram negativas, dependiendo de la composición que mostraran en su pared celular. Esta es una de las técnicas más usadas en la microbiológica diagnóstica, incluso hoy en día.
Con el paso del tiempo la técnica ha pasado por algunas modificaciones, especialmente por aquellas hechas por Hucker en 1921 con el fin de poder estabilizar los reactivos y mejorar así la calidad de esta técnica, razón por la que la técnica que se usa hoy también se le conoce como Gram-Hucker, pudiendo variar en ocasiones.
¿Qué usos tiene la técnica Gram-Hucker?
Usando la técnica Gram-Hucker también se puede identificar más fácilmente la forma de los distintos microorganismos, es decir, gracias a esta técnica es bastante sencillo identificar si se trata de bacilos, coco, cocobacilos, filamentosos, pleomórficos, etc. Además, la técnica también facilitó la forma en la que se conoce su distribución en el espacio, es decir.
Por ejemplo, cuando biólogos o médicos sospechan de una infección bacteriana, generalmente ponen una muestra sobre una lámina portaobjetos y la tiñen con Gram, para poder examinarla mejor usando el microscopio.
Una vez analizadas las muestras usando la técnica Gram-Hucker, el médico puede orientarse mejor sobre el tipo de microorganismos que están presentes en la muestra, pudiendo conocer cuál es la causa de la infección aún antes de tener el resultado definitivo obtenido del cultivo.
Es decir, usando esta técnica es muy fácil ver si hay coco Gram positivos dentro de un líquido cefalorraquídeo, permitiendo que los médicos puedan estar mejor orientados para dar una terapia de antibióticos inicial para comenzar a liminar las bacterias; siempre siguiendo las pautas y protocolos establecidos.
Cuando el médico reciba el resultado final en el que se muestre el nombre del microorganismo aislado, el médico puede determinar si es necesario cambiar la terapia que había iniciado con antibióticos o no.
Fundamentos de la tinción de Gram
La técnica de tinción de Gram tiene 4 fundamentos básicos:
- Tinción
- Fijación con mordiente
- Decoloración
- Contra tinción
Gracias a estos cuatro fundamentos es que la técnica, además de permitir pintar las bacterias, permite que los médicos e investigadores puedan diferenciarlas más fácilmente.
Primero se coloca el cristal violeta, que tiene afinidad por el peptidoglicano, por lo que pintara de morado a todas las bacterias que estén presentes en la muestra. Después se coloca el lugol, que desempeña el trabajo de un mordiente, lo que significa que induce a la formación de complejos insolubles de cristal violeta-yodo dentro de las células.
En el caso de las bacterias de Gram positivas, estas presentan una pared gruesa de peptidoglicano que forman más complejos (cristal violeta), pudiendo retener el colorante aplicado. Asimismo, las paredes de estas bacterias positivas tienen una mayor concentración de ácido no saturado, que demuestran afinidad por el lugol (agente oxidante).
Por otro lado, las bacterias negativas de Gram tienen una bacteria externa que es muy rica en lipopolisacáridos, los cuales se encuentran presentes en su pared celular. Cuando tienen contacto con el alcohol acetona, las grasas son destruidas y la membrana externa pierde estabilidad, liberando el cristal violeta.
Así, después es contrateñida con fucsina básica o safranina, que le da un tono rojo.
Las bacterias de Gram positivas pueden resistir la decoloración gracia a que el decolorante que se usa cierra los poros, impidiendo que el complejo de cristal violeta se salga.
Materiales usados en la tinción de Gram
La técnica de coloración usa un set de materiales básico:
- Cristal violeta
- Alcohol acetona
- Lugol
- Fucsina básica o safranina
Cómo preparar los colorantes y reactivos
Solución de cristal violeta
Solución A
Cristal violeta (2 gr)
Alcohol etílico (20 cc)
Solución B
Oxalato de amonio (0.8 gr)
Agua destilada (80 cc)
Se tiene que diluir la solución A 1:10 en agua destilada y después se mezcla con 4 partes de la solución B. Se reserva durante 1 día (24 horas) para poder usarse.
Solución Iodo-Lugol
- Cristales de Iodo (1 gr)
- Ioduro de potasio (2 gr)
- Agua destilada (300 cc)
Es necesario disolver el potasio en agua (poco a poco) y después agregarle el Iodo. La solución tiene que trasladarse a un frasco de color ámbar.
Solución de decolorante
- Alcohol etílico 95% (50 ml)
- Acetona (50 ml)
Esta solución se prepara mezclando partes iguales. Tiene que taparse bien para evitar que se evapore y cuando se vaya a usar se coloca en un gotero.
Solución madre safranina
- Safranina (2.5 gr)
- Alcohol etílico 95% (100 cc)
La safranina tiene que disolverse en 100 cc de alcohol de 95%. Después se tiene que preparar la solución de safranina de trabajo, en la que se tiene que medir 10 cc de la solución reservada y se agrega 90 cc de agua destilada, completando los 100 ml necesarios.
